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真空冷凍干燥技術(shù)在培養(yǎng)基凍干中的應(yīng)用

 更新時間:2024-08-21 點擊量:514

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對人類社會的影響是不可估量的。近年來生物學(xué)的進(jìn)步在很大程度上依賴于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。此外,基于細(xì)胞培養(yǎng)的實用技術(shù)在各個領(lǐng)域得到了發(fā)展,包括新藥的療效和毒性評估、疫苗和生物制藥的制造以及輔助生殖技術(shù)。隨著體細(xì)胞重編程最近在技術(shù)上變得可行,世界各地的研究人員正在激烈競爭再生醫(yī)學(xué)發(fā)展的地位。同樣,在這一領(lǐng)域,細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)也被視為進(jìn)一步發(fā)展和普及的基礎(chǔ)。

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中最重要的因素是培養(yǎng)基,如最小基本培養(yǎng)基(MEM)、Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、DMEM-f-12培養(yǎng)基和RPMI培養(yǎng)基,這些培養(yǎng)基不僅對細(xì)胞代謝、氧化還原狀態(tài)和一些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有著深遠(yuǎn)影響,對細(xì)胞形態(tài)和分化也有著極大影響。培養(yǎng)基維持細(xì)胞存活和增殖,以及細(xì)胞功能,這意味著培養(yǎng)基的質(zhì)量直接影響研究結(jié)果、生物制藥生產(chǎn)率和輔助生殖技術(shù)的治療結(jié)果。因此,對于從事細(xì)胞培養(yǎng)工作的研究人員來說,選擇適合其目標(biāo)的合適培養(yǎng)基至關(guān)重要。在某些情況下,研究人員應(yīng)該自己調(diào)整培養(yǎng)基的成分。此外,當(dāng)遇到問題時,研究人員必須了解介質(zhì)的特性,以便確定實驗出現(xiàn)問題的原因。

在研發(fā)這些培養(yǎng)基時,其主要目的是確保以低成本實現(xiàn)高細(xì)胞增殖率和生物量生長,并避免頻繁補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)。目前,根據(jù)添加的補(bǔ)充劑類型,合成培養(yǎng)基可分為幾種,例如,含血清培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基、無蛋白培養(yǎng)基和化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基。含血清的培養(yǎng)基含有各種血清衍生物質(zhì),這使得培養(yǎng)基成分不明確,其濃度可能因批次而異。這種情況使培養(yǎng)結(jié)果的可重復(fù)性降低,并存在微生物污染的風(fēng)險。然而,含血清的培養(yǎng)基可以很容易地配制出來,并有效地用于各種細(xì)胞類型,因為血清含有大量的活性物質(zhì),這些活性物質(zhì)是動物細(xì)胞存活和生長所必需的。相比之下,無血清培養(yǎng)基具有確定的成分,從而實現(xiàn)結(jié)果的高可重復(fù)性,并且培養(yǎng)過程可以得到驗證。此外,如果培養(yǎng)條件配置為有益于靶細(xì)胞,則可以在混合細(xì)胞群中選擇性地生長靶細(xì)胞。在無血清培養(yǎng)基中,無蛋白培養(yǎng)基(不含任何蛋白質(zhì))和化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基(不含任何未定義成分)的亞組為培養(yǎng)系統(tǒng)提供了額外的穩(wěn)定性和可重復(fù)性,有助于識別細(xì)胞分泌物并降低微生物污染的風(fēng)險。然而,無血清培養(yǎng)基很難設(shè)計:迄今為止,只有特定的細(xì)胞類型以這種方式培養(yǎng)。

目前,用于細(xì)胞培養(yǎng)的常用培養(yǎng)基配方已上市。因此,有些研究人員在使用培養(yǎng)基時一般不會了解其詳細(xì)信息和背景,特別是關(guān)于其開發(fā)的基本原理、確切成分以及這些培養(yǎng)基適合的細(xì)胞類型。


每種基礎(chǔ)培養(yǎng)基都是根據(jù)細(xì)胞類型、來源(動物種類)和培養(yǎng)目的在每種情況下設(shè)計的。事實上,培養(yǎng)基成分可能會有很大差異。例如,MEM(由Eagle開發(fā))是在有血清補(bǔ)充劑的假設(shè)下設(shè)計的,因此僅包含限度的必要成分(無機(jī)鹽、糖、必需氨基酸和水溶性維生素)。相比之下,用于無血清培養(yǎng)的培養(yǎng)基199和Ham's F-12含有各種其他成分。研究人員可以在實驗比較后選擇幾種培養(yǎng)基。MEM、DMEM或Ham的F-12通常用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng);懸浮細(xì)胞一般選擇RPMI 1640培養(yǎng)基;用于無血清培養(yǎng)的混合培養(yǎng)基,如DMEM/F-12。


建立無血清培養(yǎng),使用無血清培養(yǎng)系統(tǒng)時,有兩點需要注意。首先,在傳代培養(yǎng)過程中,可以在培養(yǎng)容器中選擇非預(yù)期的細(xì)胞克隆,因為無血清培養(yǎng)基比含血清培養(yǎng)基更能促進(jìn)特定細(xì)胞克隆或細(xì)胞亞型的增殖。其次,無血清培養(yǎng)基中的雜質(zhì),無論是可避免的還是不可避免的,可能比含血清培養(yǎng)基對培養(yǎng)細(xì)胞的影響更大。此外,無血清培養(yǎng)還有其他注意事項,即盡量減少胰蛋白酶的濃度和粘附因子。


4-(2-羥1乙1基)-1-哌1嗪乙磺酸(HEPES)具有很強(qiáng)的緩沖能力,在培養(yǎng)基中可能具有緩沖作用。特別是當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞在二氧化碳培養(yǎng)箱外處理時,使用HEPES的培養(yǎng)基的pH值比僅使用碳酸氫鹽的培養(yǎng)基更穩(wěn)定。它也可能對高細(xì)胞密度的培養(yǎng)有益,例如,當(dāng)pH值由于代謝物(如乳酸)的積累而迅速下降時。對于缺乏血清緩沖能力的無血清培養(yǎng)基,HEPES的pH緩沖作用可能更為重要。然而,HEPES可能對某些類型的細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)面影響,例如雞胚骨骺軟骨細(xì)胞和小鼠胚胎干細(xì)胞(ES 細(xì)胞)。研究還表明,在培養(yǎng)基暴露于可見光期間,含有HEPES的培養(yǎng)基會產(chǎn)生更高水平的細(xì)胞毒性產(chǎn)物,主要是過氧化氫。

酚紅作為pH指示劑添加到培養(yǎng)基中,有時會影響細(xì)胞的增殖并顯示出雌激素活性。因此,測試酚紅的這些特性是否會影響他們的細(xì)胞和經(jīng)驗結(jié)果,尤其是當(dāng)涉及雌激素敏感細(xì)胞(如乳腺細(xì)胞)時。


介質(zhì)的污染,不明來源的異物可能會污染培養(yǎng)基,從而可能影響實證結(jié)果。通常,這些污染物包括病毒、細(xì)菌、支原體和內(nèi)毒素。然而,還有其他類型的污染物,如增塑劑,可能會從塑料器械中洗脫出來,這些物質(zhì)也會影響培養(yǎng)物中的細(xì)胞。因此,研究人員可以考慮嚴(yán)格采用無菌技術(shù),并謹(jǐn)慎選擇培養(yǎng)器械。在某些特殊情況下,建議在使用前立即用培養(yǎng)基清洗儀器。


培養(yǎng)基凍干粉應(yīng)用在制備皮膚修復(fù)、抗皮膚衰老、修復(fù)皮膚氧化應(yīng)激損傷和修復(fù)皮膚紫外線損傷的產(chǎn)品中,產(chǎn)品包括藥物、護(hù)膚品或化妝品。通過添加凍干保護(hù)劑將含有大量干細(xì)胞分泌物質(zhì)的條件培養(yǎng)基冷凍干燥成固體粉末,穩(wěn)定細(xì)胞因子性質(zhì),使其能發(fā)揮最大的功效,特別是添加海藻糖除了能夠作為凍干保護(hù)劑,保護(hù)條件培養(yǎng)基中細(xì)胞因子的活性,同時海藻糖本身具有抗氧化作用,延緩細(xì)胞衰老。

傳統(tǒng)用于外周血淋巴細(xì)胞染色體制備采用的培養(yǎng)基一般為在液體狀態(tài)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(如RPMI1640)的基礎(chǔ)上添加一定量血清和植物血球凝集素(PHA)而成。利用PHA對處于Gtl期的淋巴細(xì)胞的刺激作用,使之進(jìn)入分裂周期,從而能進(jìn)行染色體核型分析。但液體狀態(tài)的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基不利于室溫下存放,其包含的活性物質(zhì)如谷氨酰胺、PHA等易失活。即使在2-8℃低溫存放一段時間后培養(yǎng)基,培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞中可進(jìn)行核型分析的處于分裂相數(shù)目顯著下降。利用凍干技術(shù)制備培養(yǎng)基凍干粉是解決上述問題的方法。但到目前為止,并沒有發(fā)現(xiàn)太多提供具體的培養(yǎng)基凍干工藝或方法的公開報道。



富睿捷培養(yǎng)基凍干

實驗樣本:培養(yǎng)基

實驗?zāi)康模?/strong>去除所有水分,凍干成粉末

實驗設(shè)備:真空冷凍干燥機(jī)Venues2501


真空冷凍干燥技術(shù)在培養(yǎng)基凍干中的應(yīng)用

實驗過程:

1.打開凍干機(jī)預(yù)冷。

2.將樣品分裝到合適的容器內(nèi)預(yù)凍。

3.將預(yù)凍好的樣品放入透明倉內(nèi),啟動凍干機(jī)。

4.凍干結(jié)束后,釋壓取出凍干好的樣品,儲存或者進(jìn)行后續(xù)實驗。

實驗結(jié)果:凍干前后對比圖

真空冷凍干燥技術(shù)在培養(yǎng)基凍干中的應(yīng)用